由此可見(jiàn)有關(guān)qPCR制定一個(gè)實(shí)驗和發(fā)表標準是多么的重要。不過(guò)幸好，Clin Chem. 2008年發(fā)表一篇文章，就是一群qPCR大牛經(jīng)過(guò)商討制定的qPCR實(shí)驗和發(fā)表文章指南。雖然文章有些年限，但是對我們研究還是很有用的。因此科研動(dòng)力打算在此貼出。
這篇指南題為實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗研究發(fā)表最小信息(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, MIQE)，目的就是為了幫助確認科學(xué)文獻的完整性，提高不同實(shí)驗室之間結果的一致性，并且提高實(shí)驗的透明度。
MIQE是描述評估qPCR實(shí)驗的所需的最小信息，該指南是稿件投稿時(shí)需要同時(shí)提交的一個(gè)清單。通過(guò)作者提供相關(guān)的實(shí)驗相條件和實(shí)驗特點(diǎn)，審稿人可以評價(jià)實(shí)驗所用方法的可靠性。另外提供詳細的實(shí)驗所用試劑、序列和分析方法，其他研究人員可以利用這些信息進(jìn)行重復實(shí)驗。MIQE的細節應當作為在線(xiàn)發(fā)表的一個(gè)附件或者簡(jiǎn)要形式同時(shí)發(fā)表。
實(shí)時(shí)定量PCR可以通過(guò)熒光定量檢測和測量微小量的核酸，適用范圍很廣，可以檢測多種不同來(lái)源的組織樣本，在分析診斷學(xué)，生命科學(xué)，農學(xué)和醫學(xué)中應用很廣，是一種優(yōu)秀的技術(shù)方法。
因為qPCR操作簡(jiǎn)單，檢測速度快，敏感性和特異性好，還可以對核酸定量的特點(diǎn)，qPCR已成為核酸定量實(shí)驗的標準方法。qPCR除了作為一種研究方法，其在診斷中也有廣泛應用，如微生物定量，基因定量，轉基因食品中外源基因的鑒定，癌癥復發(fā)的風(fēng)險評估以及法醫中的應用。
利用qPCR技術(shù)的研究文獻也是數量驚人，這些文章使用不同的試劑，方法，分析法和報道格式。但是由于缺乏如何最佳的操作qPCR實(shí)驗共識，qPCR一些不足可能會(huì )引起很多不良后果，這阻礙了qPCR成為一個(gè)獨立的標準。影響qPCR檢測性能的技術(shù)上的不足包括以下幾點(diǎn)。
- 缺少足夠的樣本，制劑和核酸質(zhì)量，從而產(chǎn)生高度可變的結果。
- 反轉錄引物和PCR引物以及探針選擇性差，導致效率低下，與其強大的檢測性能不成比例。
- 不恰當的數據和統計分析，產(chǎn)生可能是高度誤導的結果。
因此大量有關(guān)qPCR發(fā)表的文獻中存在結果證據不足甚至是相互矛盾的結果，這對科學(xué)研究是一個(gè)很大的危險?？茖W(xué)文獻的發(fā)表和撤回也為人們提出了警示。多數研究報告缺少足夠的信息加劇了這個(gè)問(wèn)題，使用qPCR的文獻沒(méi)有提供足夠的實(shí)驗細節，可以讓讀者評估結果的質(zhì)量或者重復實(shí)驗。具體表現為樣本的采集和處理信息，RNA質(zhì)量和完整性，反向轉錄細節，PCR效率，以及分析參數等等，這些信息常常被忽略，然而樣本正規化是反對沒(méi)有價(jià)值的單一參考基因。
本文的目的是為作者、審稿人和編輯提供一個(gè)最低限度的信息(附表，見(jiàn)文末，并且提供PDF和Excel版本下載)，是qPCR實(shí)驗必須附加的信息，以保證實(shí)驗的實(shí)用性、準確性、正確的解釋和可重復性。MIQE參照了類(lèi)似的DNA微陣分析草案，蛋白組學(xué)實(shí)驗指南，基因序列規范，以及有關(guān)RNA干擾和代謝組學(xué)討論等內容。該指南最初都是在MIBBI (Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations, http://www.mibbi.org)基礎上產(chǎn)生的。雖然很多指南最終會(huì )發(fā)展成強制數據分享使用同一格式，但是MIQE并不建議這樣做。MIQE的目的是提高結果的可靠性，以資保證科學(xué)文獻的完整性，提高不同實(shí)驗室之間結果的一致性，以及提高實(shí)驗的透明度。應當結合最近發(fā)表的文獻閱讀qPCR的指南，這樣可以深度操作qPCR的標準化。
該指南由9部分組成，共85個(gè)參數，以確保以qPCR實(shí)驗的實(shí)用性、準確性、正確的解釋和可重復性。這9部分包括：實(shí)驗設計(Experimental design)，樣本(Sample)，核酸提取(Nucleic acid extraction)，反轉錄(Reverse transcription)，靶基因(qPCR target information)，qPCR引物和探針(qPCR oligonucleotides)，qPCR實(shí)驗報告(qPCR protocol)，qPCR合理性(qPCR validation)和數據分析(Data analysis)。85個(gè)參數視其對發(fā)表qPCR結果時(shí)的必要性，分為兩類(lèi)：標記為「E」表示必須(essential)，標記為「D」者表示建議(desirable)。
1. 術(shù)語(yǔ)
首先先定義幾個(gè)術(shù)語(yǔ)先以確保澄清事實(shí)。
1.1 實(shí)時(shí)定量PCR的簡(jiǎn)寫(xiě)
建議實(shí)時(shí)定量PCR (quantitative real-time PCR) 應當簡(jiǎn)寫(xiě)為qPCR，反轉錄PCR (reverse transcription–qPCR) 應當簡(jiǎn)寫(xiě)為RT-qPCR。用RT-PCR簡(jiǎn)寫(xiě)表示qPCR可以引起混亂，并且與傳統RT-PCR的平常應用不符。
1.2 內參基因
內參基因應當指的是參照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。
1.3 TaqMan探針
TaqMan探針應指的是水解探針(hydrolysis probes)。
1.4 FRET probe
FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉移探針)指的是一種機制，基于2個(gè)熒光基團的電子激發(fā)狀態(tài)之間的相互作用的基礎上的發(fā)光/淬火。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。
1.5 定量 quantification
牛津英語(yǔ)詞典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰當的。
1.6 Cq
現在文獻中使用的閾值循環(huán)(threshold cycle, Ct)，交點(diǎn)(crossing point, Cp)和分支點(diǎn)(take-off point, TOP) 與PCR反應周期中的術(shù)語(yǔ)不一致。這些術(shù)語(yǔ)指的實(shí)際上在實(shí)時(shí)儀器是相同的值，只是不同儀器廠(chǎng)家為了競爭給自己產(chǎn)品的特定定義，不具有準確性和清晰性。根據實(shí)時(shí)定量PCR的標記語(yǔ)言的數據標準(www.rdml.org)，建議同一使用定量循環(huán)(quantification cycle, Cq)這個(gè)術(shù)語(yǔ)。
2. 概念
為了解釋指南，我們回顧一下qPCR實(shí)驗有關(guān)的一些關(guān)鍵性問(wèn)題。
2.1 分析敏感性(Analytical sensitivity)
分析敏感性指實(shí)驗準可以確測量樣本的最小拷貝數，而臨床敏感性(clinical sensitivity)指實(shí)驗可以確定患種疾病的陽(yáng)性人數的百分比。通常靈敏度表示為檢測限(limit of detection, LOD)，即分析方法可以檢測濃度的合理定性(常用95%的概率)。最敏感的LOD理論上可能是3拷貝/PCR，假設符合泊松分布，PCR有95%的可能性至少包含和檢測到1個(gè)拷貝。實(shí)驗步驟通常包括樣本處理(如提取)，有時(shí)還需要反向轉錄過(guò)程。如果總量有變化，這些步驟的效率可以引起多數LOD敏感性變化，理論上表現在可能在與實(shí)驗有關(guān)的單元上，如每克組織的拷貝數。不應報道實(shí)驗結果少于理論上LOD可能性的結果。同樣結果為「0」也是無(wú)意義和可引起誤導的。因為當模板濃度是0時(shí)Cq是不確定的，在qPCR分析LOD的評估因Cq的對數而變得復雜。在qPCR中適當的確定和調節LOD是持續研究的重點(diǎn)。
2.2 分析特異性(Analytical specificity)
分析特異性指qPCR檢測相應的靶序列而不是樣本中其他同樣表達的非特異性序列。診斷特異性是(Diagnostic specificity)指實(shí)驗確定為陰性的沒(méi)有某種疾病的百分比。
2.3 精度(Accuracy)
精度指實(shí)驗測量和實(shí)際濃度之間的差異，代表了倍數變化或者估計拷貝數。
2.4 重復性(Repeatability)(短期精度或者批內變異(intraassay variance))
重復性指同樣樣本使用同樣方法重復檢測的精度和穩定性?？梢杂肅q的SD變化表示，也可用拷貝數或濃度變化的SD或者CV來(lái)表達。但是不能用CVs和Cqs表達。
注：批內變異指一個(gè)實(shí)驗得到的一組數據的變異。每個(gè)樣本測量多次，多次測量之間的差異。
2.5 再現性(Reproducibility)(長(cháng)期精度或者批間變異(interassay variance))
再現性指不同實(shí)驗室或者操作之間的結果變化，通常表現為拷貝數或濃度的SD或者CV。Cq值一般由不同操作產(chǎn)生，服從于固有的批間變異(interrun variation)，因此單純的報道批間Cq變化并不恰當。
文章中描述靶基因的mRNA濃度應該可以使靶基因更精確。多數人類(lèi)基因和其他多核細胞生物中的很多基因的轉錄是選擇性剪接，這些剪接變化可以改變蛋白質(zhì)亞型，不同組織或者不同時(shí)期都有這種剪接模式的變化。因此單一外顯子RT-qPCR法可能檢測到許多剪接變化，但是內含子引物可能更有選擇性，但是這又可能丟失一些剪接變異。最近有報道稱(chēng)常染色體非印跡基因(nonimprinted genes)表達時(shí)表現為等位基因失衡?？傊?，使用RT-qPCR評價(jià)一個(gè)靶基因或者最多2個(gè)外顯子的mRNA不足以表現特定基因水平。因此作者要把引物序列信息及其相對于已知剪接體變化的特異性，以及單核核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)等這些信息記錄在案和單核核苷酸多態(tài)性數據庫中。對于選自RTprimerDB數據庫的引物設計倒很簡(jiǎn)單，直接查詢(xún)RTprimerDB的網(wǎng)站(http://www.rtprimerdb.org)即可，這個(gè)數據庫包含了所有相關(guān)的信息。如果是商業(yè)公司提供的引物，還需要提供一些信息以及供應商的實(shí)驗驗證標準。強烈不建議使用未驗證的商業(yè)分析結果，以及僅有in silico驗證的商業(yè)分析。
必須記住的是檢測mRNA提供不了是否mRNA能翻譯成蛋白質(zhì)的信息，或者實(shí)際上能翻譯成一個(gè)功能蛋白質(zhì)的信息。
免疫組化，免疫蛋白印跡法，或者其他蛋白質(zhì)定量方法常不能定量細胞mRNA?，F在已明確mRNA濃度和蛋白質(zhì)濃度之間的一致性，特別是mRNAs和多功能蛋白質(zhì)復合體中一個(gè)特定蛋白質(zhì)之間的一致性?，F在已明確特定microRNA是了解基因表達非常重要的，因為它量化mRNA種類(lèi)。
還應注意多數RNA定量不是絕對的，而是相對的。由此用參考基因或者作為標準材料是至關(guān)重要的，任何評價(jià)RT-qPCR實(shí)驗的有效性也必須考慮相對定量的參考基因。因此開(kāi)發(fā)通用參考DNA和RNA標準材料，雖然很有用，但是不是一個(gè)萬(wàn)能藥。
RT-qPCR實(shí)驗產(chǎn)生的表達值的很多變異并不只是由于實(shí)驗步驟的變異引起，而是由于不同數據處理算法的校正引起的，每個(gè)算法都是數據假設。因此雖然qPCR是試金石或者金標準，但是實(shí)際中這個(gè)標準是可變的，結果需要考慮分析和解釋復雜性。
3. 研究和診斷應用
qPCR技術(shù)的應用可以大致分為研究應用和診斷應用。研究應用常用于分析量少的范圍廣泛的靶基因或者不同的樣本類(lèi)型的靶基因。主要是需要解決有關(guān)分析敏感性和特異性等參數，在這種情況下分別是可以檢測多少個(gè)靶拷貝以及無(wú)模板對照(no-template controls, NTCs)是否確實(shí)是陰性。
診斷應用卻是相反，它常用于分析一定數量的靶基因，但是需要一些樣本靶基因是高產(chǎn)的。雖然研究應用也可用于診斷實(shí)驗，但是臨床診斷實(shí)驗有額外的要求，如分析的敏感性和特異性，也就是指有靶基因標本能檢測出多少陽(yáng)性結果，以及無(wú)靶基因樣本能檢測出多少陰性結果。甚至不同實(shí)驗室之間的準確度和精確度常由外部質(zhì)量控制程度控制。臨床實(shí)驗室還要求可報告結果的標準，樣本的是否重復檢測，假陽(yáng)性/假陰性結果的解決方法，多個(gè)實(shí)驗室用于同樣和不同技術(shù)結果的相似似性。迄今為止只有幾個(gè)國際實(shí)驗公司進(jìn)行該類(lèi)實(shí)驗，并且這些研究重點(diǎn)在于qPCR診斷實(shí)驗的標準化。另外歐盟SPIDIA項目(Standardisationand Improvement of Generic Preanalytical Tools and rocedures for In-Vitro Diagnostics; http://www.spidia.eu)也有些實(shí)驗正在進(jìn)行此類(lèi)實(shí)驗。
4. 樣本采集、處理和制備
樣本的采集可能是實(shí)驗變異的第一個(gè)來(lái)源，特別是RNA實(shí)驗，因為mRNA的特性易被樣本的采集和處理而不穩定。建議新鮮組織可以保存在冰塊中，這對RNA的質(zhì)量和濃度沒(méi)有多大的影響，但是雖然這種保存方法對一些mRNA和組織是有效的，它也不可能普遍應用。因此在樣本采集時(shí)應當謹慎。由此應詳細記錄組織樣本的采集以及是否及時(shí)處理等信息。如果樣本沒(méi)有及時(shí)處理，必須記錄是如何保存的，以及在什么情況下保存了多長(cháng)時(shí)間。
樣本的簡(jiǎn)要說(shuō)明也是必不可少的。例如一個(gè)腫瘤樣本的顯微鏡鏡檢可以發(fā)現樣本由腫瘤細胞組成的比例，這些信息也需要報道。
核酸的提取是第二個(gè)關(guān)鍵步驟。提取效率取決于足夠的同質(zhì)化，樣本的類(lèi)型(如原位組織和培養組織)，樣本密度，生理狀態(tài)(如健康、癌癥或者壞死)，基因復雜性，以及處理量。因此必須記錄核酸取方法的細節，以及檢測核酸濃度和評估質(zhì)量的方法。這些細節對從新鮮冰凍顯微切割標本中提取RNA特別重要，因為組織提取過(guò)程對RNA的數量和質(zhì)量影響很大。
5. 核酸質(zhì)量控制
5.1 RNA樣本
提取樣本中的RNA定量分析很重要，因為比較不樣本時(shí)，使用大致相似相同數量的RNA是明智的。平常使用的有幾種量化方法，如分光光度法(NanoDrop; Thermo Scientific)，微流控分析法(Agilent Technologies’ Bioanalyzer, Bio-RadLaboratories’ Experion)，毛細管凝膠電泳法(Qiagen’s QIAxcel)，或者熒光染料檢測法(Am-bion/Applied Biosystems’ RiboGreen)。這些方法可以有不同的結果，因此用不同方法比較結果是不明智的。定量RNA推薦使用熒光RNA結合染料(如RiboGreen)，該方法是檢測低濃度樣本最好的方法。建議任何情況下檢測所有樣本使用同一種方法，并且報道這些信息。
外源性基因組DNA污染程度和這種污染容忍的閾值也是很重要的。必須報道RNA樣本是否經(jīng)過(guò)DNase處理(包括DNase類(lèi)型和反應條件)，每個(gè)核酸樣本的獲得的Cqs研究組和非反轉錄的控制組的陽(yáng)性果之間比較結果。
RNA模板的質(zhì)量評估也是必不可少的，唯一例外當提取的總RNA質(zhì)量太低以至于不能評價(jià)質(zhì)量時(shí)。這種情況一般發(fā)生在從單一細胞、血漿或其它體液中提取RNA，以及一些激光捕獲樣本或者組織培養收集的樣本提取RNA時(shí)。這種情況同樣適用于RT-qPCR持續單管試驗。需要報道RNA數量，融合和沒(méi)有反轉錄或PCR抑制劑等關(guān)鍵信息。應該記住體內RNA降解是由于mRNA因自然刺激的自然調節。RNA降解是研究人員無(wú)法控制的，其表現之一是高質(zhì)量的RNA樣本可以表現單個(gè)mRNAs的不同降解。
A260/A280比值必須在中性PH值buffer中測量，但是這個(gè)比值如果于核酸用于定量分析，尤其是目的是為了測量細胞mRNA濃度的微小差異(＜10倍)時(shí)，這個(gè)比值不夠用。吸收度比值提供了RNA純度指標，因為DN或者殘余苯酚可以改變這個(gè)比率。因此至少應該提供凝膠電泳證據，或者更好能提供微流控芯片的rRNA分析結果，或者一個(gè)參考基因/靶基因3’:5’完整性檢測。使用Bioanalyzer/Experion系統計算RNA完整性數量或RNA質(zhì)量指標數量的優(yōu)點(diǎn)是這些指標可以提供有關(guān)RNA樣本一般狀態(tài)的定量信息。但是要記住這些與rRNA質(zhì)量有關(guān)的數字不能期望作為質(zhì)量的絕對指標。使用3’:5’分析要求兩個(gè)實(shí)驗的PCR效率幾乎相同，不受不同抑制劑的控制。這個(gè)實(shí)驗還需要一個(gè)閾值來(lái)定義RNA質(zhì)量產(chǎn)量不足可信結果。理想狀太下檢測目標是一組「可靠參考基因」，可能沒(méi)有內含子，3’:5’的倍數大約是0.2-5。顯然需要進(jìn)一步的工作開(kāi)發(fā)一個(gè)評價(jià)RNA完整性的工具，既有普遍適用性，又有成本效益和操作簡(jiǎn)單。
應當通過(guò)稀釋樣本(最好)檢測反轉錄活性或者PCR抑制劑，或者使用一般的抑制試驗如SPUD。如果RNA樣本部分降解，這個(gè)信息必須報道，因為實(shí)驗的低水平轉錄檢測敏感性可能減少，轉錄的降解的相對差異可能引起不正確的比率。
5.2 DNA樣本
一般情況下DNA降解比較少，但是法醫學(xué)評價(jià)外源性DNA降解是重要的，如惡劣環(huán)境犯罪或者大規模災害，或者涉及失蹤人員案件中，DNA化學(xué)結構可能出現降解。qPCR擴增片段大小可以幫助減少測定有關(guān)的問(wèn)題，但是開(kāi)發(fā)供DNA質(zhì)量的定量檢測方法可用于這種特殊用途。
可能的抑制劑是更普遍可變因素，必須在發(fā)表中指出，沒(méi)有抑制劑純化的DNA可能會(huì )扭曲結果，比如病原體的檢測和量化。雖然可以添加樣本與陽(yáng)性對照來(lái)檢測抑制劑，但是不同的PCR反應可能會(huì )受抑制劑影響。因此最好是常規使用核酸稀釋來(lái)證明Cqs或拷貝數的減少是與預期結果一致的。
6. 反轉錄
反轉錄步驟可以引起RT-qPCR的實(shí)質(zhì)性變異。因此詳細描述轉化RNA成cDNA的方法和試劑是必不可少的。RNA反轉錄的量，啟動(dòng)策略，酶的類(lèi)型，數量，溫度，持續時(shí)間和反轉錄步驟等等這些信息必不可少。建議反轉錄步驟可以進(jìn)行次或者三次，每個(gè)樣本中總RNA濃度應是相同的。
7. qPCR
以下信息qPCR試驗必須提供的：數據庫登陸每個(gè)靶基因和參考基因的數目，每個(gè)引物和任何探針的外顯子位點(diǎn)，每個(gè)寡核苷酸的濃度和序列，包括性質(zhì)、位點(diǎn)和結合任何染料和/或修飾堿基。同樣需要聚合酶的名稱(chēng)和濃度，每個(gè)反應的模板(DNA或RNA)數量，Mg2+濃度，緩沖液中確切化學(xué)組成(鹽、PH值、添加劑)，以及反應量。研究人員還必須確認他們所使用的儀器，所有PCR循環(huán)條件的文件。因為所使用的耗材影響熱循環(huán)，必須確定使用單一試管、帶或者板，以及它們的制造商。所使用的塑料制品的透明度，如白色或者透明，這也重要，因為不同的塑料的熒光反射敏感性不同。當使用板時(shí)，密封(熱粘合或粘合劑)的方法可以影響板周邊樣品的蒸發(fā)，這也要記錄。
因為PCR效能高度依賴(lài)于所使用的引物，因此引物的序列必須發(fā)表。這個(gè)要求是完全可行的，甚至是商業(yè)性的引物，因為有先例(http://www.primerdesign.co.uk/research_with_integrity.asp)。
另外強烈建議提交給公共數據庫，如RTprimerDB，這些數據庫可以成為通用的交換所。
7.1 二級結構
目標核酸的結構(如RNA的莖環(huán)結構)對反轉錄和PCR的效率有重要影響。因此，引物和探針的位點(diǎn)，以及PCR擴增產(chǎn)物的位點(diǎn)必須考慮RNA的折疊?？梢杂煤塑账嵴郫B軟件仔細核實(shí)序列，這類(lèi)軟件有DNA的mfold(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)，或者RNA的mfold(http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-form1-2.3.cgi)。理想狀態(tài)下折疊結構應該提供給審稿人。
7.2 特異性
In Silico 工具如 BLAST 或者等效性搜索是實(shí)驗設計有用的。應當記錄任何可預測的假基因的同源或者其它不可預見(jiàn)的基因，并且作為一個(gè)序列比對提供給審稿人。但是特異性必須用直接的實(shí)驗證據(凝膠電泳，解鏈曲線(xiàn)圖形，DNA序列，擴增片段大小，和/或限制性酶切)驗證有效性。
設計之初可預測寡核苷酸的熔解溫度(Tm)的算法，但是退火的實(shí)際最佳溫度必須通過(guò)實(shí)驗決定。雖然引物優(yōu)化已成為過(guò)去時(shí)，但是不當的退火溫度優(yōu)化對實(shí)驗質(zhì)量有很大的影響還是明確的。引物二聚體的顯可引起PCR低效率，在探針和SYBRGreen Ⅰ的實(shí)驗中可能產(chǎn)生假陽(yáng)性。引物優(yōu)化的一些證據應提給審稿人，最好還要提交退火溫度或者M(jìn)g2+濃度，Cq值，熒光點(diǎn)陣圖與循環(huán)次數，和/或熔解曲線(xiàn)。
7.3 控制和量化標準
除了RT-qPCR實(shí)驗上面所提到的非反轉錄控制外，所有qPCR反應還需要更多的控制和/或量化標準。在SYBR Green I反應中應當用探針區別預期PCR產(chǎn)物中區別不可預知的擴增產(chǎn)物(如引物二聚體)時(shí)，應用NTCs檢測PCR污染。NTCs應當包含在每個(gè)板或者批樣品中，并建立拒絕條件。如果Cq值未知最高值為35，那么如NTCs的Cqs≧40可以忽略。
從實(shí)驗樣本中提取的核酸的陽(yáng)性對照可用于監測實(shí)驗隨時(shí)間變化，并且當每次操作不執行校準曲線(xiàn)時(shí)陽(yáng)性對照就必不可少。
量化校準器可以純化靶分子，如RNA合成或DNA寡核苷酸生成完整PCR擴增，質(zhì)粒DNA結構，cDNA克隆成質(zhì)粒，RNA體外轉錄，參考RNA，特定生物樣品的RNA或者DNA，或者國際公認的生物標準(如果有)。稀釋到規定tRNA載體(酵母或者10-100ng/L的大腸桿菌)濃度。為了檢測人的病原體，避免引起載體tRNA出現溶解，校準可以稀釋成陰性對照樣本RNA或者DNA，或者把它們稀釋到健康人的血漿。特定模板的稀釋可為存儲作準備，能抵抗幾個(gè)凍溶循環(huán)。當Cq變化0.5-1.0時(shí)準備幾個(gè)新鮮稀釋。另外在4℃存儲一周，超過(guò)一周就要丟棄。
qPCR用于診斷分析應包括一個(gè)獨立的校正標準， 一般位于實(shí)驗的線(xiàn)性區間內。同樣也建議陽(yáng)性和陰性提取對照。
7.4 檢測性能
必須確定下面的實(shí)驗特性：PCR效率，線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍，LOD，精度。
7.4.1 PCR效率
穩定和精確的qPCR實(shí)驗常和PCR效率有關(guān)。當靶基因相對于參考基因的mRNA濃度時(shí)PCR的效率特別重要。△△Cq法是基于單一參考基因的標準化最流行確定不同濃度樣本的差異性的方法。計算靶基因和參考基因Cq值(△Cq)的差異，直接比較不同樣本△Cqs。擴增兩個(gè)基因以比較這兩個(gè)基因的效率。但是最流行的方法不一定是最合適的，不過(guò)現在已開(kāi)發(fā)替代的定量模型用于糾正擴增效率，還可以使用多個(gè)參考基因。
PCR擴增效率必須建立校準曲線(xiàn)，因為這種校準提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速以及可重復PCR效率、分析敏感性和實(shí)驗的穩定性的平均指標。效率放大應當從l校準曲線(xiàn)的og線(xiàn)性部分的斜坡部分決定。具體而言PCR效率＝10-1/slop-1，初始模板濃度的對數(獨立變量)是X軸，Cq(依賴(lài)變量)是Y軸。理論最大值為1.00(或100%)表示每個(gè)周期的產(chǎn)物量加倍。理想狀態(tài)下PCR的估計平均效率的CIs或SEs服從校準曲線(xiàn)。
每個(gè)量化目標的校準曲線(xiàn)必須包含在提交稿件中，這些信息審稿人可以看到。校準曲線(xiàn)的斜率和Y截距必須包含在發(fā)表中。不同PCR效率可以產(chǎn)生不同的校準曲線(xiàn)和不同的斜率。因此靶基因和參考基因的Cq值不同可以保持不變，但是模板量是變化的，計算相對濃度是不準確的，易產(chǎn)生誤導性結果。
Cq＞40是可疑的，因為擴增效率低。使用這種Cq值是不理想的，因為它們可能太低(沒(méi)有有效的結果)或者太高(假陽(yáng)性結果增加)。
7.4.2 線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍
反應的動(dòng)態(tài)范圍是線(xiàn)性的(最高到最低量化的拷貝數通過(guò)校準曲線(xiàn)表示)。根據生成校準曲線(xiàn)的模板，動(dòng)態(tài)范圍應當包括至少3個(gè)數量級，理想狀態(tài)5或6 log10濃度。校準曲線(xiàn)的線(xiàn)性間隔必須包括目標核酸量化的間隔。因為量化的低限常不明確，應當確定線(xiàn)性間隔內最低濃度的變化。必須報道相關(guān)系數(r2值)，理想是CIs應當通過(guò)整個(gè)線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍。
7.4.3 LOD
LOD為檢測到陽(yáng)性樣本最低濃度為95%。換句話(huà)說(shuō)，包含一組靶基因復制內LOD的濃度最多不超過(guò)5%失敗反應。低拷貝PCRs是隨機有限的，不可能出現LODs為3個(gè)拷貝/PCR。如果是多個(gè)反應，可通過(guò)數字PCR得到低濃度的準確定量。實(shí)際上濃度校準器可以通過(guò)檢測有限的稀釋?zhuān)『统晒Ψ磻陌俜直确螾oisson分布。
7.4.4 精度
很多因素可以解釋qPCR結果的變異，包括溫度的差異可影響退火和/或變性，濃度不同可由移液濃度錯誤引起，以及隨機變異。qPCR精度的一般隨著(zhù)拷貝數減少而變化。理想狀態(tài)是實(shí)驗內變異(重復性)在圖中應當表現為標準誤，或者重復樣本的在校準曲線(xiàn)作為CIs。CVs不能用作Cqs，但是可用于表達拷貝數或濃度的變化。這種技術(shù)上的變化應該有別于生物變異。生物復制可直接解決不同組或治療組之間的qPCR結果的統計學(xué)差異。診斷分析，報道不同部位和不同操作者之最批間精度(重復性)可能同樣是必須的。
7.4.5 多重qPCR
qPCR分析的能力可以擴展到多重的，特別是就應用于同時(shí)檢測點(diǎn)突變或多態(tài)性檢測。多重需要提供證據表明多個(gè)目標的準確量化在單一管中不受損，比如檢測效率和LOD是相同的，當檢測單工模式時(shí)。當靶基因濃度很低又和高濃度的靶基因同時(shí)擴增時(shí)這個(gè)問(wèn)題尤其重要。
8. 數據分析
數據分析包括原始數據檢查，其質(zhì)量和可靠性評估，以及可值得報告結果的產(chǎn)生。數據采集和提交的變異策略已描述過(guò)了，系統性評價(jià)顯示qPCR的數據分析方法不同于其性能。
數據分析方法和可信度估計的詳細信息是必須的，同時(shí)所使用的軟件說(shuō)明書(shū)。確定殿堂值和如何處理這些數據的方法必須指出。記錄實(shí)驗精度需要確認用于評價(jià)變異的統計方法(如95% CIs)和相應的濃度或Cq值的出現。這些信息應包括重復性和再現性數據，如果可用。如上所述，報告CVs為Cqs是不恰當的，因為Cqs常低于(因此可能誤導)CVs計算的拷貝數量值。信息必須提供用于評價(jià)準確性的方法，包括組間差異的統計學(xué)意義。
8.1 規范化(Normalization)
規范化是一個(gè)可知的qPCR檢測重要的組成部分，因為這個(gè)過(guò)程控制提取的變化，反轉錄的量，擴增效率，從而可以通過(guò)不同樣本比較mRNA濃度。使用參考基因作為內部控制是最常用規范化細胞mRNA數據的方法，但是雖然使用參考基因被大多數適當規范化策略所接受，但是它們的用途必須為特定的組織或者細胞和特定的實(shí)驗設計經(jīng)實(shí)驗驗證其有效。不幸的是雖然大家越來(lái)越意識到系統性確認的重要性，大家也知道使用不恰當的參考基因作為規范有潛在的高度誤導性，但是很多人還是一直忽視這些因素。因此很多分子分析仍然包含沒(méi)有規范化的qPCR數據。
規范化涉及到報告研究基因和參考基因RNA濃度的比率。參考基因的mRNA應當穩定表達，它們的豐度應當和樣本中mRNA總量強相關(guān)。
規范化反對使用一個(gè)參考基因，除非研究人員有明確的給審稿人提供明確的證據，證實(shí)其在實(shí)驗條件下保持不變。參考基因最佳數量和選擇必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗測定和報告的方法來(lái)證實(shí)。
8.2 變異性
生物系統內在的變異可能競爭或者超過(guò)實(shí)驗兩組間的差異。當多個(gè)生物提制用于增加實(shí)驗的統計差異性時(shí)，這種變化更易觀(guān)察到。雖然生物復制之間的差異可能很大，但是足夠數量的樣本可以減少實(shí)驗差異性。最近一份研究提供了處理這些數據的范例，如何從高生物變異實(shí)驗樣本中提取有意義的數據。很多因素可以引起實(shí)驗變異，影響生物復制的數量以實(shí)現給定的統計結果。因此效率分析對決定樣本數量是有用的，對可靠的結果是必須的。
8.3 定性分析
PCR的使用僅檢測核酸模板的存在，而不是準確量化，被稱(chēng)為定性PCR，現在廣泛用于病原體的診斷。PCR方法定性/定量分層總是一個(gè)準確是/否答案，需要低敏感性PCR實(shí)驗的敏感性的信息。因此甚至定性分析應當提供實(shí)驗操作的特性，特別是在7.4.2和7.4.3中討論的要點(diǎn)。
結論
現大大家認為必須確保qPCR和RT-qPCR實(shí)驗的質(zhì)量。qPCR和傳統的PCR之間最主要的不同是qPCR量化靶基因更準確。由于這種差異，一個(gè)不能認為傳統的PCR可以直接轉換成qPCR模式。表提供了作者發(fā)表qPCR研究的準備清單。E項目是必須，不僅可以讓研究人員評價(jià)工作，還可以讓其他研究人員可以重復實(shí)驗。項目D同樣重要，建議研究中考慮這些條目。當然運用常識也很重要：上百個(gè)基因的初始篩選完成表中的所有項目到是不必要。但是一旦限制了靶基因(少于20個(gè))，實(shí)驗應當按照清單中的要求進(jìn)行，清單還可以在http://www.rdml.org/miqe.php查看。
總之這個(gè)指南的目的有3個(gè)：
1. 為了讓作者設計和發(fā)表qPCR實(shí)驗有更大的內在價(jià)值。
2. 為了讓審稿人和編輯可以評估技術(shù)質(zhì)量和不按既定標準的提交稿件質(zhì)量。
3. 為了遵循這個(gè)指南的作者已發(fā)表研究更易重復。
因此研究人員使用這個(gè)廣泛使用技術(shù)可以產(chǎn)生更規范，更可比的，更可知的數據。
附表：作者、審稿人和編輯MIQE清單
MIQE checklist for authors, reviewers, and editors
| Item to check | Importance |
| Experimental design | |
| Definition of experimental and control groups | E |
| Number within each group | E |
| Assay carried out by core lab or investigator's lab? | D |
| Acknowledgement of authors' contributions | D |
| Sample | |
| Description | E |
| Volume/mass of sample processed | D |
| Microdissection or macrodissection | E |
| Processing procedure | E |
| If frozen - how and how quickly? | E |
| If fixed - with what, how quickly? | E |
| Sample storage conditions and duration (especially for FFPE samples) | E |
| Nucleic acid extraction | |
| Procedure and/or instrumentation | E |
| Name of kit and details of any modifications | E |
| Source of additional reagents used | D |
| Details of DNase or RNase treatment | E |
| Contamination assessment (DNA or RNA) | E |
| Nucleic acid quantification | E |
| Instrument and method | E |
| Purity (A260/A280) | D |
| Yield | D |
| RNA integrity method/instrument | E |
| RIN/RQI or Cq of 3' and 5' transcripts | E |
| Electrophoresis traces | D |
| Inhibition testing (Cq dilutions, spike or other) | E |
| Reverse transcription | |
| Complete reaction conditions | E |
| Amount of RNA and reaction volume | E |
| Priming oligonucleotide (if using GSP) and concentration | E |
| Reverse transcriptase and concentration | E |
| Temperature and time | E |
| Manufacturer of reagents and catalogue numbers | D |
| Cqs with and without RT | D* |
| Storage conditions of cDNA | D |
| qPCR target information | |
| If multiplex, efficiency and LOD of each assay | E |
| Sequence accession number | E |
| Location of amplicon | D |
| Amplicon length | E |
| In silico specificity screen (BLAST, etc) | E |
| Pseudogenes, retropseudogenes or other homologs? | D |
| Sequence alignment | D |
| Secondary structure analysis of amplicon | D |
| Location of each primer by exon or intron (if applicable) | E |
| What splice variants are targeted? | E |
| qPCR oligonucleotides | |
| Primer sequences | E |
| RTPrimerDB identification number | D |
| Probe sequences | D** |
| Location and identity of any modifications | E |
| Manufacturer of oligonucleotides | D |
| Purification method | D |
| qPCR protocol | |
| Complete reaction conditions | E |
| Reaction volume and amount of cDNA/DNA | E |
| Primer, (probe), Mg++ and dNTP concentrations | E |
| Polymerase identity and concentration | E |
| Buffer/kit identity and manufacturer | E |
| Exact chemical constitution of the buffer | D |
| Additives (SYBR Green I, DMSO, etc.) | E |
| Manufacturer of plates/tubes and catalog number | D |
| Complete thermocycling parameters | E |
| Reaction setup (manual/robotic) | D |
| Manufacturer of qPCR instrument | E |
| qPCR validation | |
| Evidence of optimisation (from gradients) | D |
| Specificity (gel, sequence, melt, or digest) | E |
| For SYBR Green I, Cq of the NCT | E |
| Standard curves with slope and y-intercept | E |
| PCR efficiency calculated from slope | E |
| Confidence interval for PCR efficiency or standard error | D |
| r2 of standard curve | E |
| Linear dynamic range | E |
| Cq variation at lower limit | E |
| Confidence intervals throughout range | D |
| Evidence for limit of detection | E |
| If multiplex, efficiency and LOD of each assay | E |
| Data analysis | |
| qPCR analysis program (source, version) | E |
| Cq method determination | E |
| Outlier identification and disposition | E |
| Results of NTCs | E |
| Justification of number and choice of reference genes | E |
| Description of normalisation method | E |
| Number and concordance of biological replicates | D |
| Number and stage (RT or qPCR) of technical replicates | E |
| Repeatability (intra-assay variation) | E |
| Reproducibility (inter-assay variation, %CV) | D |
| Power analysis | D |
| Statistical methods for result significance | E |
| Software (source, version) | E |
| Cq or raw data submission using RDML | D |
注：
1. All essential information (E) must be submitted with the manuscript. Desirable information (D) should be submitted if available. If primers are from RTPrimerDB, information on qPCR target, oligonucleotides, protocols, and validation is available from that source.
2. FFPE, formalin-fixed, paraffin-embedded; RIN, RNA integrity number; RQI, RNA quality indicator; GSP, gene-specific priming; dNTP, deoxynucleoside triphosphate.
3. Assessing the absence of DNA with a no–reverse transcription assay is essential when first extracting RNA. Once the sample has been validated as DNA free, inclusion of a no–reverse transcription control is desirable but no longer essential.
4. Disclosure of the probe sequence is highly desirable and strongly encouraged; however, because not all vendors of commercial predesigned assays provide thisinformation, it cannot be an essential requirement. Use of such assays is discouraged.
*: Assessing the absence of DNA using a no RT assay is essential when first extracting RNA. Once the sample has been validated as RDNA-free, inclusion of a no-RT control is desirable, but no longer essential.
**: Disclosure of the probe sequence is highly desirable and strongly encouraged. However, since not all commercial pre-designed assay vendors provide this information, it cannot be an essential requirement. Use of such assays is advised against.
本文編譯于：Bustin SA et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-22. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797. Epub 2009 Feb 26. PMID:19246619
