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1、 酵母單雜能不能用mating的方法？
不能，因為Y1HGold和Y187都是α型，不能融合生長(cháng)。

2、 細胞質(zhì)蛋白用哪種方法篩庫？
可以用核體系也可以用膜體系，最好用膜體系。

3、 共轉是把AD轉到帶有BD的Y2HGold還是BD、AD一起轉到Y2HGold?
都可以,如果是AD轉到帶有BD的酵母菌用SD-trp的培養基搖菌。

4、 篩到的蛋白經(jīng)測序后，從AAA AAA后翻譯的結果有好多都移碼？
三框文庫不是不移碼，而是保證您的文庫中的每個(gè)基因的克隆都至少有一種不移碼的情況存在，即您的文庫表達的目的蛋白中總有正確的蛋白存在。 所以出現移碼情況需要分析測序峰圖而不是只看測序結果，也許峰圖上有某個(gè)位點(diǎn)缺失導致序列移碼，這種情況需要手動(dòng)調整序列。理論上肯定只有不移碼的基因才會(huì )被篩選出來(lái)。

5、如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，該怎么辦？
    在某些情況下，在液體培養基中培養不好的菌珠可以在固體培養基上生長(cháng)得很好。首先重懸克隆于1ml的SD/–Trp，接著(zhù)將重懸液平鋪于5 個(gè)100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下溫浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每塊板上的克隆，并收集到一管中，這樣就可以使用這個(gè)細胞重懸液進(jìn)行正常的雜交反應。

6、如果誘餌蛋白能直接激活報告基因的表達，該如何處理？
      該蛋白很可能有轉錄激活域，是個(gè)轉錄因子?？梢酝ㄟ^(guò)基因重組切掉轉錄激活域，然后重新檢測其是否自激活，但要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。

7、轉化效率太低怎么辦？
     可以采用以下方法解決：
1) 檢測一下DNA的純度，如果可以的話(huà)，重新用乙醇純化。
2) DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。
3) 不適當的培養基，重新配制培養基，并做對照轉化。
4) 檢測pGBT9對照載體的轉化效率，放置于SD/–Trp平板上，轉化效率應該在1 x 105 colonies/ug DNA以上。

8、雜交效率不高，該如何處理？
      在雜交中，預轉化的誘餌細胞的數量可能不夠。當對誘餌菌株進(jìn)行液體培養過(guò)夜時(shí)，應挑選大的、新鮮的克隆進(jìn)行培養，經(jīng)過(guò)離心和重懸后，再使用血球計對細胞進(jìn)行計數。密度應該在1 x 109/ml。
      一個(gè)甚至兩個(gè)融合蛋白對酵母細胞有毒。你可以通過(guò)重組方法來(lái)減輕毒性，同時(shí)又能保證蛋白的相互作用?；蛘呤褂帽磉_水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或濾膜上進(jìn)行雜交。但同時(shí)必須作雜交對照實(shí)驗。

9、四缺板上篩選到的陽(yáng)性克隆可以直接拿菌液或酵母質(zhì)粒去測序嗎？
   不行，因為酵母質(zhì)?？截悢档?，達不到測序濃度，所以需要將抽出的質(zhì)粒轉到大腸桿菌再測序。

10、膜系統酵母雙雜文庫如何選擇BD載體？
膜系統酵母雙雜根據誘餌基因的蛋白跨膜方式選擇不同的載體，可以根據如下網(wǎng)站預測蛋白結構進(jìn)行選擇：
http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
上面的這兩個(gè)網(wǎng)站可以分析膜蛋白的細胞內和細胞外區域。
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
這個(gè)網(wǎng)站可以具體分析蛋白的信號肽序列，以及N端是否存在cleavge site。
確定誘餌基因的蛋白結構以后根據如下表格選擇適當的載體：